Termenul de "prion" ("Proteinaceous Infectious Particle", semnificand o "proteina infectioasa") a fost introdus in biologia moleculara de Stanley Prusiner de la Universitatea din San Francisco, in 1982.
Prionii (cunoscuti anterior sub numele de protovirine, virinos, virusuri latente) reprezinta o clasa de agenti infectiosi subvirali, cu greutatea moleculara de 27.000-30.000, unici in felul lor, fiind rezistenti la toate procesele de inactivare care degradeaza acizii nucleici (caldura, razele UV, radiatiile ionizante).
Prionii sunt invizibili la microscopul electronic, fiind de 100 de ori mai mici decât cele mai mici virusuri.
Ei sunt inactivati la temperaturi de peste 136 grade Celsius (fierberea carnii nu îi inactiveaza, doar prajirea ei!).
Sunt rezistenti la radiatiile ultraviolete, la ultrasunete si la radiatiile ionizante.
De asemenea, prezinta o rezistenta deosebit de mare la multe substante chimice folosite ca decontaminanti.
Pentru descoperirile sale, doctorului Stanley Prusiner i s-a acordat în 1997, Premiul Nobel pentru Medicina si Fiziologie.
Prionii raman o enigma, "o perplexitate" a biologiei moleculare, deoarece admiterea existentei lor drept agenti infectiosi, lipsiti de acid nucleic si formati exclusiv din proteine, ar pleda pentru daramarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificari si multiplicari a acestei proteine prionice infectioase, nu prin intermediul acidului nucleic din structura agentului prionic respectiv, ci prin intermediul acidului nucleic al celulei-gazda.
Proteinele prionice exista, in mod normal, in absolut toate celulele mamiferelor, participand la structura membranelor celulare.
Bolile prionice sunt considerate astazi "pseudoinfectioase" in atie cu bolile infectioase clasice, ai caror agenti etiologici sunt microorganismele (virusuri, bacterii) care contin in structura lor acid nucleic.
Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt urmatoarele:
- afecteaza sistemul ners central, producand encefalopatii spongiforme;
- au o perioada foarte lunga de incubatie: de la cateva luni pana la 37-40 de ani;
- au o elutie lenta, progresiva, totdeauna letala.
Pana astazi au fost descrise 12 boli prionice: sase la animale si sase la om.
Dintre acestea, cel mai bine studiate sunt scrapia la animale si boala Creutzfeldt-Jakob (CJD) la om.
Celelalte zece boli prezinta similaritati de ordin clinic, anatomopatologic si histochimic cu aspectele din scrapie.
In prezent, se admit trei posibilitati de producere a bolilor prionice:
- infectia lenta;
- infectia sporadica;
- alterarea genetica.
Forma normala a proteinelor prionice este cunoscuta in literatura sub denumirea PrPc (proteina prionica celulara), dar rolul sau fiziologic nu este, inca, bine silit.
Forma infectioasa a acestei structuri este notata PrPsc (prescurtarea sc provine de la termenul scrapie, aceasta fiind boala prionica a oilor).
Din motive mai mult sau mai putin cunoscute, se pare ca moleculele proteice prionice normale (PrPc) au capacitatea de a se plia si de a polimeriza (sub actiunea foldazelor celulare), generand structuri anormale, amiloidice care se acumuleaza masiv in sistemul ners central.
Cuprins:
Caracteristicile prionilor |
sus  |
Absenta ADN-ului in structura prionilor
In incercarile de purificare a prionilor, prin electroforeza in gel-sarcosil si sedimentare in gradient discontinuu de sucroza, s-a obtinut numai izolarea unei proteine (sialoglicoproteina) cu greutatea moleculara de 27.000-30.000 D, dar nici un acid nucleic.
De asemenea, investigatiile radiobiologice au aratat ca agentul scrapiei nu poseda acid nucleic si este foarte rezistent la toti factorii fizico-chimici si la toate procedurile de inactivare eficiente pe acizi nucleici.
Aceasta extrema rezistenta a agentului scrapie la procedurile de inactivare a acizilor nucleici reprezinta un argument in plus pentru faptul ca structura prionilor este diferita de cea a virusurilor si viroizilor (ARN gol, fara manta proteica) sau pentru posibilitatea ca genomul presupus al agentului scrapiei sa fie un acid nucleic criptic (neobisnuit), aflat intr-un invelis gros de proteina care ar impiedica penetrarea actiunii nucleazelor pana la acidul nucleic.
In 1991, s-a aratat ca, daca acest acid nucleic exista, el este foarte mic si contine mai putin de 100 de nucleotide.
Deci, daca in agentul scrapie si agentii prionici inruditi exista totusi un acid nucleic, acesta este foarte mic si foarte bine protejat de o carcasa proteica impotriva razelor UV;
acest acid nucleic nu este implicat in infectivitate, ci doar proteina s-a dovedit a fi asociata cu infectivitatea.
Structura exclusiv proteica a prionilor |
sus |
Dupa cum s-a aratat, in tesutul cerebral al animalelor cu infectie prionica apar placi de amiloid si fibrile amiloide.
Amiloidul reprezinta un derivat dintr-o glicoproteina celulara normala (PrPc), care se gaseste in mod normal pe membrana celulei neuronale.
Se stie astazi ca in cursul infectiei prionice se produce conversia unei cantitati mari de proteina PrPc (prin modificari posttranslationale) in PrPsc (izoforma anormala a PrPc).
Aceasta PrPsc reprezinta tocmai SAF (proteina inalt infectioasa).
PrPc si PrPsc au aceeasi greutate moleculara (33-35 kDa), dar PrPc poate fi complet catabolizata in vitro de proteinaza K, in timp ce PrPsc este rezistenta (este doar partial catabolizata), lasand un miez rezistent la proteinaza K; acest miez este reprezentat de PrP 27-30kDa (greutate moleculara de 30 kDa).
PrPsc are o abilitate foarte mare de a determina modificari posttranslationale ale propriei molecule si de a forma amiloid, fapt ce are consecinte asupra replicarii, transmisibilitatii si neuropatogeniei bolii. Fibrilele de amiloid reprezinta produse de degradare (de rupere) a PrPsc infectioase.
Modificarile post-translationale care contribuie la transformarea PrPc in PrPsc au fost considerate un timp a fi doar modificari conformationale de impaturire.
PrPsc este derivata din PrPc in urma unor procese post-translationale
Proteina normalaPrPc are o structura primara formata din 254 aminoacizi; in conditii normale, devine functionala abia dupa un numar de modificari post-translationale de ordin chimic si conformational.
Modificari chimice ale proteinei PrPc
In literatura de specialitate au fost descrise cateva modificari, si anume:
- clivarea peptidului semnal N-terminal (cu 22 de aminoacizi);
- modificarea reziduului de arginina la nivelul codonului 25;
- glicozilarea oligozaharidelor linkate de asparagina la nivelul codonilor 181 si 198;
- formarea unui inel cu o legatura disulfidica prin care se unesc doua re ziduuri de cisteina de la nivelul codonilor 179 si respectiv 214;
- indepartarea peptidului hidrofob C terminal (cu 20 de aminoacizi) si fixarea, in schimb, a unui glicozilfosfatidilinozitol.
Modificari conformationale
Acestea presupun replierea proteinei structurale intr-o anumita configuratie de structura secundara de tip α-helix.
In aceasta forma, PrPc din celula neuronala normala isi poate pastra viabilitatea si functia normala.
Pentru realizarea acestei replieri este necesara o sursa de energie.
Conform ipotezei lui Prusiner, se admite ca rolul de enzima (sursa de energie) l-ar avea chiar proteina PrPc, pentru a-si cataliza propria impaturire (rol de autofoldaza = proteina chaperone).
In comparatie cu proteina normala PrPc, izoforma anormala PrPsc este constituita tot din 254 de aminoacizi, avand acelasi semnal peptidic format tot din 22 de aminoacizi. Dar in cazul izoformei PrPsc, izolata de la hamster cu scrapie experimental, Prusiner demonstreaza prezenta unor modificari post-translationale chimice si conformationale diferite fata de cele de la PrPc.
Prionii nu sunt imunogeni |
sus |
Spre deosebire de virusuri, care produc raspuns imun specific, prionii nu sunt imunogeni.
Bolile prionice sunt boli cu evolutie lenta, apar paradoxal in absenta oricarui raspuns imun care ar putea opune rezistenta inaintarii infectiei.
Daca ne referim la scrapie (boala prionica cea mai studiata pana astazi), replicarea agentului scrapie este un proces prezent numai in vivo, intr-un numar restrans de celule (celule permisive) tip: sistem reticulo-histiocitar (celule circulante rezistente la radiatii) si celule din SNC.
In infectia prionica naturala, prin absenta oricarui raspuns imun, se intelege:
- absenta sintezei anticorpilor specifici (anticorpi antiscrapie in boala naturala);
- absenta raspunsului celular specific;
- absenta oricaror alterari calitative, cantitative si functionale a limfocitelor T si B;
- absenta oricaror modificari ale nivelului interleukinelor.
Unele cercetari efectuate in faze clinice tardive ale bolilor prionice au evidentiat modificari ale unor constante imunologice, dar acestea au fost totdeauna nespecifice, fiind interpretate in functie de distructia majora a SNC si de stransa interrelatie dintre SNC si sistemul imunitar.
In cazul infectiei experimentale:
- la soarece, nu s-a observat nici o variatie a principalilor mesageri intracelulari (AMCc si GMPc), nici o variatie specifica a actiunii macrofagelor; au fost remarcate diminuarea activitatii celulelor NK, a citotoxicitatii celulare (a 10-14-a zi de la inocularea agentului prionic), modificarea sintezei Ig M, scaderea numarului de celule helper;
- la cobai, s-a observat modificarea anumitor fractiuni ale complementului (in CJD experimental);
- la iepure, in cazul imunizarii cu PrPsc purificat, s-au obtinut seruri cu titruri crescute de anticorpi anti-PrPsc.
Forme multiple de prioni cu grad inalt de infectiozitate
Prionii pot exista sub forma de bastoane, complexe proteice cu lipid-detergent (DLPCs) si sub forma de lipozomi. Aceste forme sunt interconvertibile; in toate aceste forme, singura molecula identificata este tot PrPsc.
Rapida interconversie a acestor forme de prioni pledeaza pentru (fara insa sa dovedeasca) faptul ca prionii sunt formati dintr-un singur tip de macromolecule (este foarte greu de inteles cum o molecula de acid nucleic, daca exista alaturi de proteina PrPsc, poate ramane atat de protejata, incat sa nu poata fi evidentiata).
Prin procesul de interconversie, PrPsc, legata de membrana prin proteoliza limitata, se transforma in PrP 27-30 legata de membrana; din aceasta, prin extractie cu detergent, se formeaza bastoane, care, la randul lor, prin adaos de fosfolipide, se transforma in bastoane dispersate in complexe de proteine-lipide-detergent (DLPC).
Aceste complexe DPLC se pot forma si direct la nivel de membrana, prin adaos de detergent si lipide.
Relatia boli prionice-ceas biologic |
sus |
Constatarea faptului ca unele boli prionice la om devin manifeste, intr-o anumita perioada a vietii (de exemplu, CJD in a sasea decada) a sugerat cercetatorilor ipoteza existentei unui mecanism de control numit "ceas biologic genetic" (timing). In conditii normale, acest "ceas biologic“ ar declansa, intr-un anumit moment al vietii, activitatea unei anumite gene (sau grup de gene).
In conditii anormale insa, acest "timing"ar determina, in loc de reglare, o dereglare a actiunii respectivelor gene si, implicit, a functiilor celulare, ceea ce ar duce in final la aparitia bolii prionice. In acest context, se admite astazi ca o mutatie survenita intr-un locus genetic ar determina la anumiti indivizi o susceptibilitate manifesta, abia in a sasea decada de viata, la infectia cu prioni (exogeni), ceea ce ar duce la declansarea formei clinice a respectivei boli prionice.
In prezent, se considera ca acelasi ceas biologic genetic, ce regleaza perioada de incubatie si declansarea bolilor prionice (tip CJD) la om, ar declansa, in raport cu varsta (la senescenta) si alte boli degenerative ale SNC (boala Alzheimer, boala Parkinson), multe aspecte anatomopatologice fiind foarte asemanatoare cu cele din bolile degenerative ale perioadei de senescenta.
In viitor, clarificarea aspectelor genetice legate de acest ceas biologic va putea aduce noi date in intelegerea declansarii si evolutiei la animalele superioare a bolilor genetice, neoplazice, degenerative, cat si a bolilor prionice la animale si la om.
In Franta, masurile de securitate prevad indepartarea din randul donatorilor de grefe a persoanelor cu risc (din familii cu cazuri de boli prionice sau persoane tratate cu hormon hipofizar).
Produsele biologice trebuie supuse obligatoriu unui tratament pentru inactivarea eventualului agent prionic prin:
- autoclavare la 138°C timp de 18 minute;
- tratare cu solutie NaOH 1N sau cloramina (solutie 2%) timp de o ora la temperatura camerei.
Tratamentul tesuturilor cu acid formic 95-100% timp de o ora nu duce la inactivarea completa a agentului prionic, ci, in aceste conditii, supravietuiesc inca circa 200 de unitati infectioase per gram de tesut. Piesele formolate trebuie autoclavate de doua ori cate o ora la 134° C sau de doua ori cate 18 minute la 138° C.
Este considerata eficienta metoda tratarii pieselor infectioase cu NaOH 1M timp de o ora, urmata de autoclavare la 121° C timp de 30 de minute.
Amfotericina B, utilizata din 1989 drept medicament anti-scrapie, a reusit doar sa prelungeasca perioada de incubatie a bolii si sa intarzie multiplicarea agentului scrapiei in SNC al animalului supus infectiei experimentale.
Problema BSE si cea a radioactivitatii ocupa in prezent aceeasi nisa psihologica in societate, in timp ce fumatul, obezitatea, abuzul de alcool, lipsa de miscare (agenti ai unor boli cu incidenta a mortalitatii extrem de mare pe tot globul) sunt total ignorati.
Intrebari care asteapta raspuns |
sus |
- Care este natura completa a agentului prionic? (Este acesta format doar din PrPsc sau contine si un al doilea component?)
- Exista un singur tip sau mai multe tipuri de prioni? Conformatii distincte de PrPsc corespund la diferite tipuri de prioni?
- Daca exista un agent prionic in mediul extern, care este rolul exact al acestui agent, ubicuitar raspandit, in declansarea bolilor prionice?
- Care este mecanismul prin care prionii transporta informatia specifica?
- Care este mecanismul prin care substituirile de aminoacizi din PrPc (modificari ale structurii primare a PrPc) ar putea modula (crea) predispozitia dezvoltarii bolii prionice la om?
Care este mecanismul de transformare a PrPc (proteina normala) intr-un "agent infectios transmisibil"ť tip PrPsc, si anume care este ponderea modificarilor de structura primara si cea a modificarilor posttranslationale in aparitia izoformei proteice patologice, in declansarea bolii prionice si in determinarea proceselor degenerative din SNC?
- Exista cu adevarat riscul transmiterii iatrogene prin sange a agentului prionic al CJD de la donatori (tratati cu hormon hipofizar contaminat) la persoanele transfuzate?
- Exista sau nu un risc de transmitere a agentului prionic al BSE de la bovine la om?
- Un numar de boli degenerative ramase pana in prezent de etiologie necunoscuta (boala Parkinson, scleroza laterala amiotrofica, diabetul, artrita reumatoida, lupusul eritematos) au drept cauza agentii prionici sau alti agenti etiologici?
Metode de studiu ale celulei |
sus |
Studiul celulei vii
Observatia vitala
Este cea mai veche tehnica histologica si de asemenea una dintre cele mai delicate
Consta in studiul celulei vii si ca urmare nu se poate aplica decat:
unui material vegetal transparent,
fara sectionare prealabila:
Ex: organisme unicelulare, culturi de celule izolate, talofite filamentoase, peri, frunze subtiri ale unor plante acvatice, epiderme, etc
Celulele trebuie plasate in mediul lor normal:
daca este vorba de plante acvatice in apa dulce sau sarata;
daca este vorba despre organisme aeriene intr-un mediu fiziologic apropiat
Cea mai mare parte a celulelor vegetale pot fi observate foarte bine intr-o solutie de zaharoza 7-8%; se pot utiliza de asemenea solutii saline echilibrate
Materialul vegetal este plasat intre lama si lamela; daca dorim prelungirea timpului de examinare se poate utiliza o camera umeda sau o camera cu ulei.
Coloratia vitala
In microscopia optica cea mai mare parte a constituentilor celulari sunt greu de evidentiat dar este posibil sa devina mai vizibili prin colorarea vitala
Aceasta tehnica consta in utilizarea de coloranti care in solutii foarte diluate se fixeaza electiv pe anumiti constituenti celulari fara a omori celula.
Ex: rosu neutru sau
albastru de cresil penetreaza in celula si se acumuleaza in vacuole, protoplasma ramanand incolora.
Alti coloranti numiti protoplasmatici sunt foarte toxici si utilizarea lor este mult mai delicata fiind vorba de fapt de o coloratie subletala
in concentratie mica verdele lui Janus si violetul de metil se fixeaza pe mitocondrii
Violetul lui Dahlia si violetul cristal se fixeaza electiv pe nucleu
Rodamina coloreaza cloroplastele
Utilizarea acestor coloranti a permis observarea distincta a mitocondriilor de micile vacuole si urmarirea evolutiei lor.
Micromanipularea
Micromanipularea permite efectuarea unor experimente asupra celulei chiar in timpul observatiei vitale
Aceasta tehnica permite cu ajutorul microinstrumentelor de sticla (micro-ace, micropipete) montate pe stativul unui microscop si care se pot deplasa in trei dimensiuni prin comenzi foarte fine sa actioneza asupra diverselor parti ale celulei (ablatia unor teritorii celulare, grefe)
Microiradierea
Poate fi considerata ca o tehnica particulara de micromanipulare
Un fascicol subtire de raze ultraviolete este proiectat pe o regiune aleasa cu grija a celulei si se evalueaza apoi efectele acestui traumatism in functie de localizarea sa
Bessis a utilizat in citologia experimentala iradierea cu un microfascicul Laser: celulele lezate de acesta prezinta aspecte variate de agonie sau de necroza in functie de punctul in care a avut loc leziunea.
Studiul celulelor moarte
Fixarea si colorarea
Observatia vitala nu este utilizabila decat in anumite cazuri particulare
Observarea celulelor moarte constituie o tehnica generala
Daca observam moartea spontana a unei celule se constata ca se produc numeroase modificari structurale
Fixarea trebuie sa omoare foarte repede celula fara a distruge structurile existente
Acesta este un ideal de care incercam sa ne apropiem cat mai mult posibil dar alterarea este o necesitate a fixarii deoarece tocmai aceste alterari ale structurilor moleculare ale protoplasmei cauzeaza moartea celulei.
Fixarea - are drept scop:
- oprirea proceselor alterative post-mortem la nivel celular si tisular prin blocajul reactiilor enzimatice;
- favorizeaza prelucrarea histologica ulterioara (includere, colorare) prin imobilizarea constituentilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de starea vitala - aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituenti ai materiei vii, ceea ce inseamna ca un bun fixator histologic trebuie sa fie un bun fixator al proteinelor; mecanismul intim al fixarii proteinelor implica fenomene de coagulare si insolubilizare a acestora;
- fixarea asigura si sterilizarea piesei prin distrugerea microorganismelor potential prezente in tesut;
- fixarea trebuie sa se realizeze in cel mult 30 min de la recoltarea piesei;
- fixarea se poate realiza prin:
- metode fizice (caldura si desicarea pt frotiuri de sange, criodesicarea pt fragmente de tesut)
sau chimice (fixatori chimici); fixatorii pot fi simpli (formolul 10% - durata fixarii 1-3 zile) sau compusi (Orth - bicromat de potasiu + sulfat de sodiu + formol, Bouin - acid picric + formol + acid acetic glacial, Carnoy - alcool + cloroform + acid acetic glacial);
Fixatorii chimici sunt in general substante toxice a caror rol este de a consolida structurile celulare cat mai aproape de organizarea lor in celula vie
Nici un fixator nu este perfect de aceea se utilizeaza reactivi complecsi obtinuti prin asocierea mai multor reactivi; cu toate acestea nu toti constituentii celulari pot fi fixati la fel de bine in acelasi timp ; rar se poate studia in acelasi preparat nucleul si condriomul de exemplu.
Primii fixatori utilizati contineau alcooli si acizi care coaguleaza puternic protoplasma
S-au cautat apoi fixatori mai putin acizi pe baza de formol, bicromat de potasiu, tetraoxid de osmiu, acestia respectand mai bine structurile citoplasmatice.
Exemple de fixatori:
-Pentru nucleu: Carnoy, Flemming, Bouin
-Pentru citoplasma si mitocondrii: Regaud
-Polivalent: Helly
O alta metoda de fixare este prin tratare fizica
Prin incalzire rapida sunt coagulate proteinele (aceasta tehnica este utilizata in microbiologie si hematologie )
O alta metoda de fixare este prin racire cu conditia de a evita formarea cristalelor de gheata
Criodesicarea necesita o aparatura speciala; preparatele sunt congelate rapid in isopentan (ales datorita conductibilitatii sale termice mari) la temperatura azotului lichid (-196oC) apoi deshidratate la vid la o temperatura cuprinsa intre -20 si -60 oC; se include apoi direct in parafina lichida; aceasta tehnica este teoretic cea mai buna deoarece imobilizeaza imediat structurile celulare si este evitata actiunea agentilor chimici, dar utilizarea sa este destul de delicata.
Criosubstituirea este o practica mult mai simpla
Probele sunt congelate la temperatura scazuta ca si in cazul criodesicarii apoi deshidratate in alcool etilic absolut la -40oC sau in butanol pana la solubilizarea totala a ghetii; se includ apoi dupa tehnica clasica
Pentru a judeca valoarea unei fixari este necesar sa putem compara aspectul celulei dupa fixare cu cel al celulei vii, fapt ce nu este realizabil decat pentru unele tipuri celulare
Daca se examineaza o cultura bacteriana sau sangele celulele pot fi fixate si colorate pe lama : metoda frotiului
In cazul celulei vegetale este posibil sa se fixeze si sa se coloreze celule intregi (talofite filamentoase, epiderma celulelor vegetale, culturile de tesuturi); tesuturile meristematice pot fi introduse intregi intr-o solutie acetica de colorant (carmin, orceina) la cald; astfel sunt deopotriva fixate si colorate si se pot apoi disocia celulele intre lama si lamela prin presiune progresiva (metoda squash)
Cel mai adesea pentru a examina o proba este necesar sa se practice sectiuni cu ajutorul unui microtom si apoi colorarae preparatului.
Caracteristicile prionilor
